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中国动物疾病模型的重大进展,亨廷顿舞蹈病基因敲入猪出生的第一例
时间:2019-03-08 15:11:07 来源:科学实验在线 作者:匿名



1872年,亨廷顿氏病首先被美国医学家乔治·亨廷顿发现并因此命名。病人会表演舞蹈和舞蹈,因此也被称为“致命的舞蹈”。

事实上,亨廷顿氏病是一种类似于阿尔茨海默病(AD),帕金森综合征(PD),肌萎缩侧索硬化症(ASL)等的神经退行性疾病。但与阿尔茨海默氏症等疾病不同,亨廷顿舞蹈病是一种常染色体显性疾病。这意味着只要父母一方有疾病,孩子就有50%的机会面临同样的命运,甚至几代人也很难逃脱“诅咒”。

目前,尚无有效的治疗方法。 “看着他死”是患者家属的最后一步。在过去的20年中,制药公司已经进行了近100项临床试验,研究了亨廷顿氏病的41种不同药物组合,但只有2种药物获得许可,只能缓解症状。

最新的发展是成功建立了这种疾病的大型动物模型。 3月30日,北京时间,顶级学术期刊《细胞》(Cell)发表了中国科学家在线的一项重大成果:首次使用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术(SCNT)成功培育世界。第一个亨廷顿病基因被敲入猪中以准确模拟人类神经退行性疾病。两个月前,获得世界上第一个单克隆细胞克隆猴的中国科学家的结果也发表在期刊上。

论文的作者是逍遥大学粤港澳中西部造林教授李小江,赖良学研究员,中国科学院广州生物医学与健康研究所,埃默里大学李世华教授。李小江是亨廷顿病研究领域的权威。 2008年,李世华与世界上第一个使用基因改造方法建立了非人类灵长类动物猴子的亨廷顿病模型。赖良学一直致力于克隆猪等大型哺乳动物。 2010年,他与李小江,李世华合作,建立了第一个转基因亨廷顿病的猪模型。

赖良学在采访澎湃新闻(www.thepaper.cn)时说:“过去长期存在的问题是我们使用转基因克隆技术试图建立亨廷顿病的大型动物模型,但缺点是转基因是指基因的插入位置不能被控制和表达。这个数量也是无法控制的,因此以前从转基因克隆中获得的猪或猴子存活了几天,并且不能准确地称为模型。“赖良学提到,2013年CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现使得该亨廷顿病动物模型研究工作曙光初现。研究团队已经投入了四年的时间来获得结果。

着名细胞生物学家,同济大学前院长,中国科学院院士严刚表示,2008年,我们制定了国家科技研究发展与再生研究计划专项规划,我们以前瞻性的方式策划了一次大规模的实验。动物模型包括猪和猴的繁殖内容,并在随后的“严重细胞国家重大科学研究计划”中继续增加资金。

根据邯钢的评价,中国在转基因猴和克隆猴的研究方面取得了突破性进展。这一次,中国科学家在猪的疾病模型研究方面取得了重大进展,表明中国已经在世界范围内研究大型动物模型。前沿将极大地促进中国生物医药产业的创新和发展。

多年来亨廷顿病研究的权威专家杨向东教授也指出,亨廷顿舞蹈病基因敲入猪的建立是神经退行性疾病领域的一个里程碑式发现,使科学家能够更好地了解神经。细胞死亡的机制和寻找有效的治疗方法。

敲入人类疾病基因

亨廷顿氏病的原因是在患者的亨廷顿氏病基因外显子1中发生CAG三核苷酸重复突变,其反过来导致编码的亨廷顿蛋白(HTT)聚谷氨酰胺(polyQ)序列的编码。事实上,除亨廷顿氏病外,多聚谷氨酰胺序列延长可导致至少8种其他神经退行性疾病,包括脊髓小脑性共济失调,脊髓肌肉骨骼萎缩(肯尼迪病)。

值得一提的是,亨廷顿氏病是一种由单基因突变引起的神经退行性疾病,这使其成为一种理想的疾病模型,可用于研究蛋白质错误折叠如何引起选择性神经退行性疾病。基因突变的基础。

研究小组使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将人突变的亨廷顿基因(人类外显子1)准确插入到猪亨廷顿内源基因中。研究小组通过PCR筛选了2,430个融化的胎猪成纤维细胞,最终鉴定出9个阳性克隆细胞。研究小组选择了一个细胞克隆进行体细胞核移植,最终获得了2,880个胚胎。将胚胎转移到16只替代猪中,其中10只替代猪在怀孕期间成功,并且在流产后获得7只天生仔猪。

PCR基因分型和DNA测序显示共有6只猪携带人类亨廷顿蛋白外显子1,延长了CAG重复。这六头猪被称为F0代。

随后,研究小组利用F0代母猪和野生型雄性巴马香猪交配获得F1代猪。将F1代公猪和野生型雌性巴马香猪交配,获得F2代猪。根据本文的数据,在过去的两年中,研究小组通过这种育种方法获得了15头F1代猪和10头F2代猪,所有这些猪都表现出亨廷顿氏蛋白阳性突变。

赖良学告诉新闻,“论文发表后,它仍然继续产生后代,现在所有被敲入猪群的基因加起来差不多50个。”

赖良学强调,“转基因技术用于转移外源基因后,猪自身的亨廷顿蛋白也同时发挥作用。这次,猪本身的基因被基因编辑破坏了。因此,猪自己的亨廷顿基因。它不会表达,纯粹表达人类致病基因。由此产生的症状和病理变化与自然发生的情况一致。“

症状,病理和人类相似

亨廷顿舞蹈病的主要特征是身体和四肢无法控制的舞蹈动作,进行性认知衰退和精神障碍。主要病理特征是脑纹状体中中脊柱神经元(MSN)的逐渐丧失。

根据论文的数据,截至论文的最终版本,最老的F0代是30个月,最大的F1是12个月,F2代仍然是新生猪。因此,研究团队的研究重点主要集中在F0代和F1代。

研究小组首先确定致病基因是否将这些基因敲入猪中,以显示与人类相关的与年龄相关的神经系统症状,以及这些症状是否传递给后代。

一般来说,患有亨廷顿氏病的患者大多在35至50岁之间,并且存在舞蹈样症状,认知和精神障碍。患者的生命持续约10至20年,甚至死亡2至3年。遗憾的是,亨廷顿氏病的发病一般超过了生育年龄并且是遗传性的,因此大多数患者在疾病发作前已经“安静地”传给下一代。赖良学提到,“除非使用基因检测,否则在发生之前很难意识到你病了。”

研究结果表明,基因敲入猪4个月前没有出现明显的症状,与同龄的同龄野猪型相比,体重增加也较小。

较老的基因会导致猪皮肤严重皱纹和下垂。一些F0基因敲入猪在5个月至10个月之间过早死亡,并且经常表现出行走畸形。这些症状与人类相似。

赖良学介绍说,“4个月后,运动能力将开始受到影响。正常行走可能看不到,但是把它放在跑步机上让它跑得很厉害。跑步不能跑,比正常的猪运动更好“这篇论文提到跑步机用于观察F0猪的运动功能。结果表明,5个月时有症状的基因不能像正常对照组一样移动,其他F0代猪也不能运动。也表现出类似的跑步困难。

值得一提的是,这个5个月大的基因敲入猪在跑步机试验后两天死亡。研究小组认为,这可能表明敲入猪的基因很难承受运动负荷,而呼吸衰竭可能是猪死亡的直接原因。

肺功能障碍和吸入性肺炎或窒息也可能是亨廷顿病患者死亡的主要原因。

此外,基因敲入猪表现出呼吸困难或呼吸不规律。目前,呼吸困难仅表现在基因敲入猪中,并且在小鼠和其他动物模型中未见。

除了这些症状之外,这些敲入猪脑的基因的选择性神经病理学与人类相似。病理学分析表明,敲入猪脑的5个月大的基因小于同龄的野生型猪,大脑皮质的厚度和纹状体的大小也较小。 5个月大的有症状的敲入猪的MRI(磁共振成像)分析也显示它们的侧脑室扩大并且纹状体尺寸减小。

此外,163例临床病例显示,与壳核相比,纹状体的尾状核预先退化。敲入猪纹状体的5个月大的症状基因也表现出一致的降解顺序。

传承下去,多因素决定生活多久

值得一提的是,研究小组试图用转基因基因建立的猴模型和猪模型毒性太大,无法表达外源致病基因片段,并在出生后不久死亡。研究团队成就的重要性之一就是实现这一段落。研究结果表明,在基因表达,体重增加,早期死亡,运动困难和呼吸困难方面,F1代与F0代相似。这意味着在亨廷顿氏病患者中发生的“遗传性”也在基因敲入猪模型中实现。

赖良学说:“与人类一样,这些猪也可以发育成性成熟(性成熟5-6个月),并且可以生育后代。 2010年,我们发表了一篇关于转基因猪的文章,其症状太明显了。表达太高,所以它在出生后几天就死了。李小江教授在美国使用过同样的转基因猴子,并没有活下去。没有它就行不通,并没有形成这种动物模型。“

然而,有趣的是,基因型分析显示CAG重复不稳定。实验结果表明,F0代有130-150个CAG,F1代有113-206个CAG,F2代有118-230个CAG。此外,CAG重复在不同组织中也不一致。

赖良学认为,这可能是发病时间不同,病情严重程度不同的原因。

一篇文章还指出,具有206个CAG的敲入猪的寿命比含有113-138个CAG的几头猪的寿命长,这表明CAG重复长度不是生命的唯一决定因素。

研究小组指出,环境压力和其他因素也会影响这些猪最终生存的时间。

该研究还发现,F1代淘汰猪是“单室”,即帮助它们减少环境压力,它们的寿命比F0代引起的“敲”猪长。

值得一提的是,该研究被认为是神经退行性疾病领域的一个里程碑式的发现。关键在于之前经常使用的模型是老鼠等啮齿类动物,物种之间的差异实际上是一个很大的研究差距。

该论文指出,虽然亨廷顿氏病小鼠模型显示突变亨廷顿蛋白的年龄相关积累,以及其他神经系统症状,但是敲入亨廷顿氏小鼠缺乏显着的神经变性,这是亨廷顿舞蹈病。经典病理学标记。当然,猪和人类比非人类灵长类动物模型更远。然而,猪模型的明显优势在于繁殖周期快(性成熟5-6个月)并且窝数量很大(平均7-8头仔猪)。赖良学说:“猴子模型可以在未来以类似的方式建立,但是通过猴子模型观察与年龄相关的神经退行性症状需要很长一段时间,并用它传递并观察后代“。

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